人类蛋白质之间的相互作用图为更好地理解蛋白质组的功能组织提供了一个有价值的框架。为了系统地检测人类蛋白质的相互作用对，通过自动酵母双杂交系统筛选了4456个baits和5632个preys的蛋白质矩阵。研究者在1705种蛋白质中鉴定出3186种主要是新的相互作用，形成了一个大的、高度连接的网络。单独的Pull-down和共免疫沉淀试验保证了酵母双杂交相互作用的总体质量。使用Topological和GO criteria开发了一个评分系统，用来定义401种蛋白质之间的911种高置信度的相互作用。系统的人类蛋白质之间的相互作用对蛋白质功能和细胞过程有更全面的理解。

高置信度的人类蛋白相互作用网络

研究者专门从数据中提取了一个高可信度相互作用网络，如下图所示。研究者使用GO和OMIM标准将蛋白质分为三大类：疾病蛋白质（45）、非特征蛋白质（49）和已知蛋白质（307）。对于45种疾病蛋白，鉴定了163种高可信度蛋白-蛋白相互作用（表S1）。这些信息可作为疾病特异性调查的资源。

如下图所示，大多数蛋白质（87%）是连接的，并形成一个大的相互作用网络。此外，获得了24个含有少于6个蛋白质的小网络。

涉及401个通过911个相互作用连接的蛋白质的高置信度相互作用网络。橙色：疾病蛋白；浅蓝色：GO注释的蛋白质；黄色：无GO和疾病注释的蛋白质。颜色编码线表示连接节点的交互：绿色：3 quality points；蓝色：4 quality points；红色：5 quality points；紫色：6 quality points。

涉及401个通过911个相互作用连接的蛋白质的高置信度相互作用网络图

实验步骤

人cDNA在酵母双杂交载体中的亚克隆

从5‘端对hEx1文库的9665个cDNAs进行测序，以确定每个片段的同源性和阅读框架。对NR (NCBI) 或tembl (Swiss-Prot) 数据库的BLASTP分析显示，通过限制性克隆将4275个cDNA插入酵母双杂交质粒pGAD426和pBTM117c中，这是一组非冗余的cDNA。从RZPD文库的源克隆中扩增出2136个人全长ORF片段，并将其克隆到pDONR201中。用BLASTP搜索对重组克隆进行测序和注释。通过重组克隆，将基因片段穿梭到酵母双杂交载体pBTM116-D9和pGAD426-D3中。矩阵中克隆的冗余度小于4%，即编码相同蛋白质不同部分的克隆。总体而言，48%的质粒编码全长ORF，而52%的质粒编码更大的人类蛋白质的C端片段。

自动的酵母双杂交系统进行筛选

为了创建相互交配的矩阵，用猎物质粒（编码Gal4激活域融合）分别转化L40ccαMATα酵母菌株（Goehler等人，2004）；将所得酵母克隆排列在384孔微量滴定板中。同时，将诱饵质粒（编码LexA DNA结合域融合）引入L40ccU MATa菌株中，并组装在96孔板中。在与表达AD蛋白的MATα菌株交配后激活HIS3、URA3和lacZ报告基因的诱饵（19.6%）被排除在自动酵母双杂交分析之外。

为了进行交互交配，使用移液机器人在384孔MTP中复制5μl MATα酵母菌株的液体培养物，培养并与40μl汇集的MATa菌株（八个诱饵）混合。然后使用定点机器人将酵母混合物转移到YPD琼脂平板上，并在30°C下孵育36小时。交配后，克隆自动从平板上摘下，并转移到含有SDII（-Leu-Trp）液体培养基的384孔MTPs中。为了选择蛋白质-蛋白质相互作用，将二倍体酵母点在SDIV（-Leu Trp Ura His）琼脂板上，以及放置在SDIV琼脂板上的尼龙膜上。在30°C下孵育5-6天后，使用软件Visual Grid评估琼脂平板和尼龙膜的数字化图像，以确定其生长和β-半乳糖苷酶活性。

为了确认相互作用，将每个池中的八个诱饵排列在96孔MTP中，并与第一个交配屏幕中确定的阳性猎物交配。在30°C下36小时后，将酵母培养物置于SDII琼脂板上，以选择表达两种蛋白融合的二倍体细胞。在30°C下4天后，在SDIV琼脂平板和尼龙膜上测定酵母菌落。

膜免疫提纯和Pull-down实验

为了表达血凝素和蛋白A标记的融合蛋白，将与酵母双杂交相同的片段分别亚克隆到PTL-HA或pcDNA3.1-PA中，并成对共转染COS-1细胞。用十二烷基硫酸钠-PAGE和免疫印迹分析两种蛋白的表达，并用96孔斑点印迹仪筛选(约3μg蛋白提取物)。洗膜6次，用抗HA单抗12CA5检测蛋白质间的相互作用。

在体外下拉实验中，将cDNA片段亚克隆到pQE30-NST或PTL-HA中。分别从大肠杆菌和COS-1细胞中制备His标记融合蛋白和HA标记融合蛋白的可溶性蛋白提取物。His标记的融合蛋白与Ni2+NTA琼脂糖珠结合(约30μg蛋白)。洗涤后(50 mM HEPES-KOH[pH 7.4]，300 mMNaC l，1%NP-40，5 mM咪唑，1 mM DTT)，在4℃下与含有潜在相互作用的HA标记融合蛋白的200μg COS-1细胞提取物孵育2小时。洗涤后，用SDS-PAGE和抗HA抗体免疫印迹分析结合蛋白。

荧光素酶实验

LEF/Tcf报告基因分析如前所述，并进行如下修改：用脂质体将0.125、0.25和0.5μg的所指示的ANP32A或CRMP1载体和0.5μg DVL表达载体与TOP或对照FOP荧光素酶报告基因和β-半乳糖苷酶载体共转染HEK293细胞。在1.25μg质粒DNA中加入空载体DNA。转染48小时后测定荧光素酶活性，并与β-半乳糖苷酶活性进行对照。采用三重转染法进行报告分析。

蛋白质-蛋白质相互作用图的计算分析

使用LL.out_hs（NCBI），通过BLASTP在nr（NCBI）或tembl（Swiss-Prot）数据库中搜索获得的登录号，将蛋白质定位到一个唯一的基因位点。酵母双杂交克隆的BLAST分析和用InParanid程序计算的与预测的黑腹葡萄球菌、线虫和酿酒酵母蛋白质组的正交学分配如表S2所示。从HPRD获得了4478个蛋白质之间14384个蛋白质-蛋白质相互作用的人类参考集。对于相互作用簇的分配，我们参考了完整的黑腹葡萄球菌酵母双杂交数据集(20439个蛋白质-蛋白质相互作用；6991个蛋白质)，线虫WI5数据集(5534个蛋白质-蛋白质相互作用；3227个蛋白质)，以及来自酿酒酵母的人工挑选的蛋白质-蛋白质相互作用目录(8946个蛋白质-蛋白质相互作用；4525个蛋白质)。使用TopNet进行拓扑分析，例如度分布、聚类系数和路径长度。NCBI Loc2Go和OBO注释GO功能，KEGG数据注释通路。

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英文原文

Stelzl U, Worm U, Lalowski M, et al. A human protein-protein interaction network: a resource for annotating the proteome. Cell. 2005.